Ez az első gyík genetikai manipulációja olyan modellszervezetet hozott létre, amely segíthet jobban megérteni a hüllők evolúcióját és fejlődését
CRISPR-Cas9 vagy egyszerűen CRISPR egy egyedülálló, gyors és olcsó gén szerkesztő eszköz, amely lehetővé teszi a genom szerkesztését törléssel, hozzáadással vagy módosítással DNS. A CRISPR mozaikszó a „Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats” rövidítése. Ez az eszköz egyszerű és pontosabb, mint a korábbi szerkesztési módszerek DNS.
A CRISPR-Cas9 eszköz a zigóta (egysejtes) stádiumban lévő organizmusokba fecskendezi be a (a) Cas9 enzimből álló DNS-konstrukciót, amely „ollóként” működik, és képes levágni vagy törölni a DNS egy részét, (b) irányítani az RNS-t – egy szekvenciát, amely illeszkedik a célgénhez, és így a Cas9 enzimet a célhelyre irányítja. Amint a DNS célszakaszát levágják, a sejt DNS-javító gépezete újra csatlakozik a fennmaradó szálhoz, és a folyamat során elnémítja a célzott gént. Vagy a gén „kijavítható” egy új módosított DNS-templát használatával, a homológiára irányított javításnak nevezett folyamatban. Így a CRISPR-Cas9 eszköz lehetővé teszi a genetikai módosításokat injektálással gén-szerkesztő oldatokat egysejtű megtermékenyített petesejtté. Ez a folyamat genetikai elváltozást (mutációt) okoz az összes később keletkező sejtben, ami befolyásolja a génműködést.
Bár a CRISPR-Cas9-et rutinszerűen használják számos fajnál, beleértve a halakat, madarakat és emlősöket, ez idáig nem volt sikeres a hüllők genetikai manipulálásában. Ennek elsősorban két akadálya van. Először is, a nőstény hüllők a spermiumokat hosszú ideig tárolják a petevezetékükben, ami megnehezíti a megtermékenyítés pontos időpontjának meghatározását. Másodszor, a hüllők tojásainak fiziológiája számos jellemzővel rendelkezik, mint például a hajlékony tojáshéj, a törékenység, a belsejében nincs légtér, ami megnehezíti az embriók manipulálását anélkül, hogy repedést vagy károsodást okozna.
Feltöltött cikkben bioRxiv 31. március 2019-én a kutatók beszámoltak a CRISPR-Cas9 használatának kifejlesztéséről és teszteléséről gén szerkesztése hüllőkben először. A vizsgálat során kiválasztott hüllőfaj trópusi volt gyík hívott Anolis sagrei vagy gyakrabban barna anol, amely a Karib-térségben elterjedt. A vizsgálatban részt vevő gyíkokat Floridában, az Egyesült Államokban egy vadon élő vidékről gyűjtötték be. Ez a faj miniatűr mérete, hosszú költési időszaka és viszonylag rövid átlagos két generáció közötti idő miatt kiválóan alkalmas a vizsgálatra.
A hüllők számára jelenleg tapasztalható korlátok leküzdése érdekében a kutatók CRISPR-komponenseket mikroinjektáltak az éretlen, megtermékenyítetlen petékbe, miközben a peték még a megtermékenyítés előtt a nőstény gyíkok petefészkében voltak. A tirozináz gént célozták meg, amely egy enzimet termel, amely szabályozza a gyíkok bőrpigmentációját, és ha ezt a gént eltávolítják, a gyík albínóként születne. Ez az egyértelmű pigmentációs fenotípus indokolta a tirozináz gén kiválasztását. A mikroinjektált peték ezután a nőstény belsejében érnek, és ezt követően természetes módon megtermékenyítik a bejuttatott hím vagy tárolt spermával.
Ennek eredményeként néhány héttel később négy albínó gyík született, ami megerősítette, hogy a gén tirozináz inaktiválódott, és gén szerkesztése folyamat sikeres volt. Mivel az utódok mindkét szülőtől származó szerkesztett gént tartalmaztak, egyértelmű volt, hogy a CRISPR komponensei sokkal tovább aktívak maradtak az anya éretlen petesejtjében, és a megtermékenyítés után az apai géneket mutáltatta. Így a mutáns albínó gyíkok manipulált tirozinázt mutattak az anyától és az apától is örökölt génekben, mivel az albinizmus mindkét szülőtől örökölt tulajdonság.
Ez az első olyan tanulmány, amely hatékonyan termel genetikailag módosított hüllőket. A kutatás hasonló módon működhet más gyíkfajoknál, például kígyóknál, amelyek esetében a jelenlegi megközelítések eddig nem jártak sikerrel. Ez a munka segíthet a hüllők evolúciójának és fejlődésének további megértésében.
***
{Ez a tanulmány jelenleg szakértői felülvizsgálatra van benyújtva. A nyomtatott verziót az alábbi DOI linkre kattintva olvashatja el a hivatkozott forrás(ok) listájában}
Forrás (ok)
Rasys AM et al. 2019. Nyomtatás előtt. CRISPR-Cas9 Génszerkesztés gyíkokban megtermékenyítetlen petesejtek mikroinjekciójával. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
